一、实验原理

CCK-8全称Cell Counting Kit-8，是一种基于WST-8的应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度检测试剂盒。其工作原理为在电子耦合试剂存在的情况下，WST-8这一物质可以被线粒体脱氢酶还原成橙黄色的甲臜产物，且其颜色深浅与细胞增殖程度成正比，与细胞毒性程度成反比。

二、实验步骤

1．制备细胞悬液，计数：

若为悬浮细胞则直接离心收集对数生长期的细胞；若为贴壁细胞则用胰酶消化后离心收集细胞。将收集到的细胞用含血清培养基重悬后，用血细胞计数板计数，再稀释为5*103~5*104个/ml的单细胞悬液。

2．细胞接种：

在96孔板中接种细胞悬液，每孔100μl，同时设计不同的浓度组，每个浓度组可设计3~6个复孔，且设置好空自组和对照组。

3．加药处理及孵育：

将培养板放入培养箱中预培养24h左右（37℃，5%CO2）。待细胞贴壁效果良好后，吸出培养基，向培养板各孔中加入不同浓度的待测物质（药物、化学试剂等）放入培养箱中孵育6~96h。

4．CCK-8孵育：

向每孔中加入10μl CCK-8溶液，加完试剂后轻轻晃动培养板以帮助混匀（防止因CCK8试剂沾在孔壁上而带来误差），加样的过程中尽量不要产生气泡，以免影响OD值读数。将培养板放入培养箱中孵育1~4h。

5．测定吸光度OD值：

用酶标仪测定450nm处的吸光度（OD）。

三、数据处理

1．计算细胞存活率的公式如下：

细胞存活率=（实验孔的OD值-空白孔的OD值）/（对照孔的OD值-空白孔的OD值）*100%

2．计算细胞抑制率的公式如下：

细胞抑制率=（空白孔的OD值-实验孔的OD值）/（空白孔的OD值-对照孔的OD值）*100%

四、注意事项

1．接种细胞数：针对标准96孔板，贴壁细胞的最小接种量为1000个/孔 (100μl培养基)。若为白细胞，接种量不低于2500个/孔 (100μl培养基)。若使用24孔板或6孔板，应预先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。

2．在细胞毒性实验中，还应考虑药物的吸收，可在加入药物的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度作为空白对照。

3．在培养箱中孵育期间，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，造成体积不准确，从而增加误差，因此，建议最外一圈的孔只加PBS，不作为测定孔用。

4．加入待测物之后培养的具体时间6~96h要看待测物质的性质和细胞的敏感性，例如6、12、24、48h。实验时可以选择不同作用时间下进行细胞毒性检测。

5．如果待检测物质有氧化性或还原性，在加入CCK-8之前要更换新鲜培养基，以去掉待测物质的影响。如果影响比较小或者没有影响，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

6．正常显色时间为1~4h，可以每半小时测定一次OD值，使其OD值保持在1~2之间后固定显色时间重复实验。

7．因为细胞种类不同，形成的formazan的量也不一样，所以如果显色不够的话，可以延长培养时间，特别是血液细胞需要较长的显色时间（5~6h）。

8．测定波长：如果样品为高浑浊度的细胞悬液，建议采用双波长进行测定，检测波长450~490nm，参比波长600~650nm，建议选650nm。

9．若暂时不测定OD值，可以在各孔中加入10μl 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，室温避光保存， 24h内测定OD值不会发生变化。

10．新鲜的CCK-8试剂为粉红色，储存时间过长则颜色加深、效率变低，最好不使用。通常情况下CCK-8试剂在0~5℃避光条件下可保存至少6个月，在-20℃下避光可以保存1年。

文章出自：验外实包   想了解更多请关注：http://www.dj-cro.com/